Lykilhönnunarsjónarmið fyrir staðfestingu á veiruúthreinsun rannsóknarsamskiptareglur um genameðferðarvörur

ICH Q5A(R2)-International Harmonization Foundation

ICH Q5A(R2) var formlega samþykkt 1. nóvember 2023 og er alþjóðlegt leiðbeiningarskjal um mat á veiruöryggi. Í samanburði við Q5A(R1) sem gefin var út árið 1999, eru mikilvægar uppfærslur í R2 útgáfunni: nýbættur kafli um mat á veiruöryggi í samfelldri framleiðslu (7. kafli); styrkt hlutverk áhættumats sem undirstaða veiruhreinsunaraðferða; innlimun næstu{10}kynslóðarröðunar (NGS) í veiruuppgötvun; og skýrar kröfur um mat á nýjum vörum og framleiðsluferlum. Q5A(R2) hefur verið samþykkt af eftirlitsyfirvöldum þar á meðal FDA, EMA og PMDA, sem veitir sameinaðan tæknilegan ramma fyrir löggildingu veiruúthreinsunar um allan heim.

NMPA-Kínverskt eftirlitskerfi

NMPA regluverkið fyrir veiruöryggi nær yfir mörg stig:

Skjalstig	Nafn skjals	Útgáfuár
Grunnskjal	Tæknilegar leiðbeiningar um fjarlægingu/óvirkjun vírusa úr blóðafurðum	2002
Grunnskjal	Almennar meginreglur fyrir tæknilega úttekt á veiruöryggismati á líffræðilegum vefjum-afleiddar afurðir og heilkjörnungafrumur-tjáðar afurðir	2005
Vöru-sértæk leiðbeining	Tæknilegar leiðbeiningar fyrir lyfjarannsóknir og mat á umsóknum um klínískar prófanir fyrir raðbrigða adeno-tengda vírusvektor (rAAV)-undirstaða in vivo genameðferðarafurða	2023
Vöru-sértæk leiðbeining	Algengar tæknilegar kröfur um lyfjagæði raðbrigða adeno-tengdra vírusvektors (rAAV)-undirstaða in vivo genameðferðarafurða fyrir umsóknir um markaðsleyfi	2025
Nýstárleg leiðarvísir	Tæknilegar leiðbeiningar um sannprófun á vettvangi á veiruúthreinsunarferlum fyrir notkun í klínískum rannsóknum á meðferðarfræðilegum raðbrigðum próteinafurðum (prófun)a	2024

a: Þessi viðmiðunarregla er í fyrsta skipti sem kínverska eftirlitsyfirvaldið hefur sett fram kerfisbundnar tæknilegar kröfur fyrir vettvangsfullgildingu á veiruhreinsunarferlum og er í samræmi við anda ICH Q5A(R2).

FDA og EMA-reglugerðarkröfur í Bandaríkjunum og Evrópu

FDA gaf formlega út leiðbeiningarskjal fyrir iðnað byggt á ICH Q5A(R2) í janúar 2024. Auk þess var kafli Bandaríkjanna lyfjaskrá (USP)<1050.1>veitir viðbótar tæknilegar leiðbeiningar um hönnun, mat og lýsingu á veiruhreinsunaraðferðum. FDA skipuleggur veiruhreinsunarmálþing á tveggja ára fresti; málþingið 2023 fjallaði um nýjustu-efni eins og nýjar aðferðir, samfellda framleiðslu, nýja litskiljunarmiðla og aðsogssíur. Helstu leiðbeiningarskjöl EMA innihalda CPMP/BWP/268/95 (Note for Guidance on Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Viruses) og EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 (Evaluational Safety Guide on Medicine of Medicine) sem hafa verið samræmd við ICH Q5A(R2).

Auðkenning veirumengunar

ICH Q5A(R2) leggur áherslu á að hönnun sannprófunar á úthreinsun veiru ætti að byggjast á yfirgripsmiklu áhættumati. Að því er varðar genameðferðarvörur ætti auðkenning á upptökum veirumengunar að taka til eftirfarandi stiga:

Frumubankastig: Innrænar vírusar (td retroveiruagnir) og duldar smitandi vírusar sem hugsanlega eru í undirlagi framleiðslufrumna (td HEK293, CHO, HeLa). HEK293 frumur eru þekktar fyrir að innihalda innrænar Ad5 E1 raðir og um það bil 900 bp EBV brot og geta tjáð afritunar{10}}hæfa adenoveiru; því ætti að gefa þessari áhættu sérstakan gaum í áhættumatinu.

Hjálparveirustig: AAV vektorframleiðsla notar venjulega aðferðir eins og þrefalda transfektion með hjálparplasmíðum, sem hafa í för með sér hættu á að mynda afritunar-hæfa adenoveiru (RCA). Að sama skapi geta pökkunarfrumur sem notaðar eru í framleiðslu lentiveiruferjura myndað afritunar-hæfan lentiveiru (RCL).

Hráefnisstig: Tilviljunarvírusar geta borist í gegnum hráefni sem notuð eru við framleiðslu, þar með talið frumuræktunarmiðla, fóður og ensím. Þessi áhætta er sérstaklega veruleg þegar notuð eru innihaldsefni úr dýra-(td sermi frá nautgripum, trypsínmeltunarlausnir).

Áhættumunur: genameðferð vs hefðbundin raðbrigða prótein

Áhættustærð	Hefðbundnar raðbrigða próteinvörur	Genameðferðarvörur
Veiru uppspretta	Innrænar veirur úr frumubanka; tilviljunarkenndar vírusar	Frumubankavírusar; hjálparveirur; afritunar-hæfir vektorar (RCV/RCL); sameining hýsils erfðamengis
Frumu hvarfefni	CHO, NS0, Sp2/0 og aðrar vel-einkenndar frumulínur	HEK293, HeLa, CHO, osfrv.; sumar frumulínur eru æxlismyndandi uppruna
Eiginleikar vöru	Prótein-lyf; vel-skilgreind uppbygging	Veiru vektor; hefur í för með sér líföryggisáhættu
Staðfestingarstefna	Fjöl-þrep veiruhreinsunar; áhersla á staðfestingu á ferliþrepum	RCV/RCL uppgötvun krafist; staðfesting og prófun bæði nauðsynleg
Staðfesting vettvangs	Gildir fyrir rótgróna ferla eins og S/D, lágt pH, nanósíun	Takmarkað notagildi vegna fjölbreytileika vektortegunda

Tafla 1. Samanburður á veiruöryggisáhættu: genameðferðarvörur á móti hefðbundnum raðbrigðum próteinafurðum

Almennar meginreglur

Val á vírusveirum er miðlægur þáttur í hönnun sannprófunaraðferða fyrir úthreinsun veiru. ICH Q5A(R2) krefst þess að val vísbendingaveiru byggist á áhættumati og taki tillit til eftirfarandi þátta:

Mikilvægi veirunnar fyrir hvarfefni framleiðslufrumu (viðeigandi veira)

Eðlisefnafræðilegir eiginleikar veirunnar (hjúpuð/ekki-hjúpuð, DNA/RNA, stærðarsvið)

Ónæmi veirunnar fyrir líkamlegri/efnafræðilegri meðferð

Greinanleiki og líföryggi veirunnar

Að því er varðar genameðferðarvörur verður val á vísbendingaveirum að auki að huga að: hlutverki ferjuveirunnar sjálfrar sem „viðkomandi vírus“; hugsanleg hætta á hjálparveirusmengun; og uppgötvunar- og staðfestingarkröfur fyrir afritunar-hæfa vírusa (RCV/RCL).

Mælt með Vírusspjaldið

Veira	Tegund	Umslag	Erfðamengi	Stærð (nm)	Valrök / umsókn
MVM	Parvoveira	Engin	ssDNA	18–26	Ó-hjúpað líkan; minnsta stærð og hæsta viðnám; hentugur fyrir nanósíunarstaðfestingu (almennt á ekki við um rAAV vektorvörur)
PPV	Parvoveira	Engin	ssDNA	18–26	Ó-hjúpað líkan; almennt notaður vísir veira fyrir blóðafurðir
Reo-3	Reóvírus	Engin	dsRNA	60–80	Ó-hjúpað líkan; miðlungs stærð; mikill líkamlegur stöðugleiki
PRV	Herpesviridae	Já	dsDNA	150–200	Hjúpað líkan; stór stærð; breitt hýsilsvið
X-MuLV	Retrovirus	Já	ssRNA	80–110	Hjúpað retroveiru líkan; viðeigandi fyrir CHO-afleidd frumuhvarfefni
BVV	Flaviviridae	Já	ssRNA	40–60	Hjúpað líkan; notað til að meta efnafræðilega óvirkjunaraðferðir (HCV staðgengill)
VSV	Rhabdoviridae	Já	ssRNA	70	Hjúpað líkan; breitt pH-þol; hentugur fyrir lág-pH óvirkjunarstaðfestingu

Tafla 2. Ráðlagður vísbending um veiruborð fyrir staðfestingu á veiruúthreinsun á genameðferðarvörum

Sérstök atriði fyrir AAV Vector vörur

Fyrir raðbrigða AAV vektorvörur krefjast tæknilegra leiðbeininga NMPA um lyfjarannsóknir og mat á umsóknum um klínískar prófanir fyrir rAAV vektor-Based In Vivo genameðferðarafurðir athygli á greiningu á afritunar-hæfum AAV (rcAAV). rcAAV vísar til AAV sem getur sjálfvirka afritun, sem venjulega stafar af einsleitri endurröðun milli hjálparplasmíðsins og AAV erfðamengisins. Greining á rcAAV er almennt framkvæmd með því að nota smitgreiningar eða qPCR aðferðir, gerðar sérstaklega á lyfinu og hreinsuðu vörunni.

Það er athyglisvert að niðurstreymishreinsunarferli fyrir AAV vektorafurðir fela venjulega í sér nukleasa meltingu, litskiljun (AEX), nanósíun og jónaskiptaskiljun (CEX/IEX). Í hefðbundinni veiruúthreinsunarstaðfestingu geta þessi ferlisþrep leitt til verulegs taps á AAV ferjunni sjálfri; því verður að íhuga samspilið milli vektor- og vísbendingavírusa vandlega við smæðar-líkanahönnun. Fyrir ákveðin ferlisþrep (td nanósíun) þar sem AAV vektortap er umtalsvert, ætti að meta hvort aðlögun ferlis sé réttlætanleg á grundvelli löggildingargagna (td aðlögun á holastærð nanósíunarhimnu).

Almennar meginreglur

Módelið fyrir-minnkun (SDM) er kjarnaverkfærið fyrir staðfestingu á veiruúthreinsun; hönnun þess verður að sýna nákvæmlega úthreinsun veiru í framleiðsluferlinu. ICH Q5A(R2), Hluti 6.2.2, krefst þess beinlínis að minnkandi líkanið haldi-samræmi við framleiðsluferlið í lykilbreytum. Fyrir genameðferðarvörur eru eftirfarandi atriði sérstaklega mikilvæg í SDM hönnun:

Fulltrúi mikilvægra ferlibreyta

Módelið -minnkunar ætti að vera í samræmi við framleiðsluferlið í eftirfarandi breytum: litskiljunarskilyrði (samsetning stuðpúða, pH, leiðni); hleðsluhlutfall (próteinmassahlutfall vektor/yfirborðs); snertingartími og hitastig; rennsli/dvalartími; hreinleika og samsetningu vörunnar. Fyrir AAV vörur ætti einnig að fjalla sérstaklega um áhrif kornastærðar dreifingar vektor og innihald tóms hylkis á nanósíunarvirkni.

Hæfniskröfur fyrirmyndar

ICH Q5A(R2) krefst fullnægjandi hæfis fyrir minnkandi-líkanið, þar á meðal: samanburð á eiginleikum vörugæða (td hreinleika, endurheimt, þéttleika); hæfi mikilvægra ferli breytu samræmi; og tryggja að -minnkunarlíkanið fangi ferlabreytileika framleiðsluferlisins. Fyrir litskiljunarþrep ætti að gæta samræmis í toppsniði, skolun og þvotti; fyrir nanósíunarþrep ætti að sannreyna áhrif rúmmálsgetu og vörusamsetningar.

LRV útreikningsformúla

Log-lækkunargildið (LRV) er kjarnamæligildið til að mæla verkun úthreinsunar veiru. ICH Q5A(R2), kafli 6.5, veitir nákvæma lýsingu á LRV útreikningsaðferðum og tölfræðilegri meðferð. Grundvallarútreikningsformúlan fyrir LRV er: LRV=log₁₀(N₀/N), þar sem N₀ er upphaflegur vírustítri eftir vírusaukningu og N er vírusafgangur eftir vinnslumeðferð. Þegar veiruafgangur fer niður fyrir greiningarmörk greiningarinnar ætti að nota matsaðferðir eins og Poisson dreifingu (td prófun á stóru-rúmmáli).

Notkun öryggisbila

Bæði ICH Q5A(R2) og EMA CPMP/BWP/268/95 krefjast mats á öryggisbili á niðurstöðum LRV útreikninga. 95% öryggisbil er venjulega notað.

Skilyrði fyrir skilvirkni

Samkvæmt tæknilegum leiðbeiningum NMPA um að fjarlægja/óvirkja vírusa úr blóðafurðum, gefur vírusfækkun sem nemur meira en eða jafnt og 4 logs til kynna að ferlisþrepið sé árangursríkt til að fjarlægja/óvirkja vírusa. Hins vegar er þessi viðmiðun ekki alger þröskuldur og ætti að meta hana á heildrænan hátt ásamt óvirkjunarhreyfifræðiferlum, vísindalegum rökum fyrir vali á vísbendingaveirum og heildarheilbrigði hönnunar staðfestingarferilsins. Að því er varðar genameðferðarvörur ætti að huga sérstaklega að uppsafnaðri úthreinsunargetu í öllum ferlisþrepum til að tryggja að heildaröryggisferill veiru sé á viðunandi stigi.

Umsókn og áskoranir við nanósíun

Veiru-varandi síun (nanofiltration) er mikilvægt veiruhreinsunarskref í niðurstreymishreinsun á genameðferðarvörum. Dæmigert vírus-varandi síur hafa um það bil 20 nm holastærð. Veiruhreinsunarkerfi nanósíunar er fyrst og fremst stærðar-útilokun og það getur í raun fjarlægt flesta vírusa sem eru stærri en himnuholastærð, þar með talið ó-hjúpaðar litlar parvóvírusar eins og MVM og PPV.

Hins vegar stendur nanósíun fyrir genameðferðarvörur frammi fyrir einstökum áskorunum: Stærð AAV-ferja (u.þ.b. 20–26 nm) er svipuð og tiltekinna vísbendingaveira (td MVM, 18–26 nm), sem getur leitt til minnkaðrar endurheimtar vektor; tóm hylki geta haft áhrif á síunarflæði og skilvirkni veirunnar; Seigja sýnis getur aukist verulega með styrk vektor. Þess vegna ætti SDM hönnun fyrir sannprófun nanósíunar að gera fulla grein fyrir áhrifum kornastærðar dreifingar vektor og innihalds tóms hylkis á síunarvirkni, og íhuga ætti að nota nanósíunarhimnur með stærri svitaholastærð eftir því sem við á.

Veiruúthreinsunarmat á litskiljunarskrefum

Jónaskiptaskiljun (IEX) er kjarnaskref í hreinsunarferlum AAV afurða, sem venjulega notar núkleasa meltingu fylgt eftir með anjónaskiptaskiljun (AEX) til að fanga tóm og gölluð hylki, eða katjónaskiptaskiljun (CEX) til fínhreinsunar á fullum hylki. Veiruhreinsunaraðferðir í litskiljunarskrefum eru meðal annars stærðarútilokun, rafstöðueiginleikar, milliverkanir á sækni og aðrir þættir. Í umræðum á FDA 2023 veiruhreinsunarráðstefnunni var lögð áhersla á að virkni veiruúthreinsunar í litskiljunarskrefum er undir áhrifum frá mörgum þáttum, þar á meðal hleðslugetu, pH, leiðni og hringrás plastefnis; nota ætti fjöl-þætta hornrétta hönnunaraðferð fyrir alhliða mat.

Veiruöryggiseftirlit í stöðugri framleiðslu

Hinn nýbætti kafli 7 í ICH Q5A(R2) setur fram sérstakar kröfur um mat á veiruöryggi í samfelldri framleiðslu. Fyrir genameðferðarvörur hefur stöðug framleiðsla orðið mikilvæg þróunarstefna, en hún kynnir einnig nýjar áskoranir um öryggi veiru. Veiruöryggisstýringaraðferðir í samfelldri framleiðslu fela í sér: -veiruhindrunarsíur í línu sem mikilvægar innilokunarráðstafanir; viðeigandi hönnun á dvalartíma og ferli flæðis; innlimun óvirkjunarþrepa með skilgreindum biðtíma; og aukin beiting aðferðagreiningartækni (PAT) fyrir rauntíma eftirlit með mikilvægum ferlibreytum.